豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是尼多病毒目（Nidovirales,又叫巢穴病毒目或套式病毒目）、冠狀病毒科（Coronaviridae）的α冠狀病毒屬成員，能夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。

PEDV表面具有1個18~23nm纖突的囊膜結構，纖突呈花瓣狀，由核心向四周呈放射狀分布，纖突末端呈球狀；病毒直徑為95~190nm，是一種單股正鏈、不分節(jié)段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28kb，含有７個開放閱讀框，分別編碼大小為150~220kDa的病毒纖突糖蛋白（S）、20~30kDa的基質蛋白（M）、7kDa的主要嵌膜蛋白（E）、58kDa的核衣殼蛋白（N）與其他蛋白。病毒表面的纖突蛋白（spike，S）具有介導細胞附著和膜融合的作用。

目前預防豬流行性腹瀉（PED）的疫苗常用甲醛氫氧化鋁滅活苗，但疫苗株與近期流行株同源性較低，能保護仔豬免受PEDV流行株感染的高效廉價的疫苗需求更加迫切。為此，來自中國農業(yè)科學院的研究團隊針對高發(fā)的GⅡ-a型流行株豬PEDV的纖突蛋白中的受體結合區(qū)（re-ceptor-bindingdomain,RDB），應用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)構建并表達了PEDV-RDB基因，通過仔豬試驗，分析其免疫原性，為PED亞單位疫苗研制提供新思路。
PEDV-RDB基因在昆蟲桿狀病毒中的表達與鑒定
根據PEDV S蛋白基因序列(AKN45969.1)將目的基因設計合成之后，將合成的基因PEDV-RBD亞克隆至桿狀病毒雙表達載體的PH啟動子下游，進行重組和鑒定。對重組桿粒Bacmid-PER進行鑒定，利用引物進行PCR擴增，鑒定成功后隨后對其進行轉染，獲得重組桿狀病毒rBV-PER。

PEDV-RBD基因結構示意圖

左：重組質粒鑒定 右：PCR鑒定

最后利用Anti-strep tag抗體和抗PEDV S蛋白抗體對重組桿狀病毒進行IFA鑒定，表明外源PEDV-RBD基因在桿狀病毒中成功表達。

IFA鑒定PEDV-RBD蛋白的表達

重組蛋白pFBD-PER的Western blot鑒定

普健生物昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)物利用經典Bac-to-Bac 技術，打造了一個快速簡便高效的桿狀病毒表達平臺；能夠快速地產生重組病毒，而且不需要繁瑣的空斑分析，大大提高了效率，蛋白生產的周期短，通量大?？梢詫崿F(xiàn)細胞從小規(guī)模培養(yǎng)到大規(guī)模發(fā)酵的過程，使得蛋白產物甚至可以達到100mg/L 的級別。如果您有相關重組蛋白表達和制備需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專員進行溝通！
利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備豬流行性腹瀉病毒（PEDV）纖突蛋白受體結合區(qū)（RDB）重組蛋 白（PEDV-RDB），將其免疫３周齡斷乳仔豬，分析其免疫原性。將PEDV-RBDP3代重組桿狀病毒接種到懸浮SF9細胞中，收獲后離心取上清液，將上清液超速離心濃縮重組蛋白。將仔 豬分為免疫組、空載體對照組和佐劑對照組，分別用制備的重組蛋白、空載體表達產物和單純佐劑免疫仔豬。

特異性抗體檢測結果

左：仔豬血清中和抗體檢測結果 右：流式細胞術分析

結果顯示，免疫后８周，PEDV-RDB重組蛋白組產生的特異性抗體效價達1:12800，中和抗體平均效價1:284，最高達1:512。流式細胞術分析CD3+CD4+雙陽性Ｔ淋巴細胞顯著高于對照組，表明重組蛋白具有良好的免疫原性，能夠激發(fā)仔豬的體液免疫和細胞免疫應答。

這項研究這為進一步利用桿狀病毒載體制備亞單位疫苗奠定了基礎，也為利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)進行其他冠狀病毒蛋白的免疫研究提供了借鑒和參考。

參考文獻

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