結核病( tuberculosis，TB) 是由結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB )引起的傳染 病。結核分枝桿菌（MTB）俗稱結核桿菌（tubercle bacillus），菌細長略彎曲，有時可見分枝，呈單、成堆或成束排列，無鞭毛、無芽胞，有莢膜?？沙霈F多形性，在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒狀，長絲形等。MTB革蘭染色陽性，不產生內外毒素。

Genome of M. tuberculosis

結核分枝桿菌基因組大小為4.4 Mb，基因組G/C含量高達65.6%，預測含4411個開放閱讀框(ORF)，其中3924個ORF被認為編碼蛋白質，50個基因編碼穩(wěn)定的RNA。如由MTB Rv3875基因編碼的早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(early secretory antigenic target of 6 kDa, ESAT-6)能誘導強烈的T細胞免疫應答，并提供一定的抗結核免疫保護；Rv3804c基因編碼的Ag85A蛋白是MTB的主要分泌蛋白Ag85復合物成分之一，可使細胞毒性T細胞的細胞毒活力升高；Rv2660c基因編碼的蛋白在MTB處于休眠狀態(tài)時仍能持續(xù)表達，提示Rv2660c基因可作為清除潛伏性感染階段MTB的作用靶點；Rv3428c位于MTB的RD11 區(qū)，編碼插入序列IS1532 的轉座酶，可引起體內的細胞與體液免疫，Rv3428c編碼的重組蛋白具有增加γ－干擾素在小鼠中的表達潛力，可作開發(fā)結核疫苗的融合抗原。有研究表明Rv3428c重組蛋白有較高的臨床應用價值，Rv3428c的重組蛋白輔助診斷陰性菌的肺結核有81. 5%靈敏度和82. 0%特異度。

為進一步探討Rv3428c在MTB特異性診斷中的研究價值，來自四川大學華西公共衛(wèi)生學院的研究人員通過同源重組得到pET28a-Rv3428c表達載體，轉入E. coli BL21( DE3)后進行IPTG誘導表達，用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白。重組蛋白免疫小鼠后進行細胞融合，間接ELISA、Western Blot篩選陽性雜交瘤細胞系，以篩選獲得的陽性雜交瘤細胞誘導小鼠產生腹水，蛋白A親和層析法純化抗體，BCA法測定濃度，ELISA和SDS-PAGE進行單克隆抗體的鑒定及亞型和效價的測定。

Construction and identification of pET28a－Rv3428c vector

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最終測序結果表明，插入序列與MTB H37Rv基因組Rv3428c公布的序列一致，表明原核表達載體構建成功。對重組蛋白進行大量表達與純化，純化的重組蛋白使用超濾管進行超濾濃縮，SDS－PAGE分析目的蛋白的表達。

Abundantly expression and purification of pET28a－Rv3428c recombinant protein

隨后，通過Western blot篩選出一株效果好的陽性雜交瘤細胞株，通過體內誘生法制備獲得Rv3428c單克隆抗體。該單抗屬于IgG2a亞類，κ型輕鏈，效價約為1∶128000，濃度為4 mg /ml。

Purification and identification of Anti－Rv3428c Monoclonal Antibody

Determination of purified anti－Rv3428c－mAb titer by ELISA

Identification of monoclonal antibody subtypes by ELISA

Identification of Anti-Rv3428c Monoclonal Antibody Subtypes

關于MTB診斷抗原的研究有很多，但應用于檢測抗原的研究相對比較空白。Rv3428c特異性地在結核分枝桿菌中表達，其他分枝桿菌中不存在該基因，因此特異性好。這項研究成功構建了MTB的RD11區(qū)Rv3428c 表達載體，大量表達并純化蛋白，成功制備Rv3428c單克隆抗體。為后續(xù)探索其在臨床樣本中的應用價值，為臨床MTB快速抗原檢測試劑盒提供參考，為尋找早期、方便快速、靈敏度高、特異性強的診斷方法奠定基礎。

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