酪蛋白是牛乳中含量最多的蛋白質(zhì)，約占牛奶總蛋白質(zhì)的80%。其中，β-酪蛋白約占酪蛋白的30%左右。有研究顯示，由于奶牛的雜交和基因突變等因素的影響，牛乳中β-酪蛋白有多達(dá)10余種變異體，其中以A1和A2為比較常見的變異體。

A2β-酪蛋白（A2，β-casein-A2）在消化過程中不會(huì)像A1β-酪蛋白（A1，β-casein-A1）一樣產(chǎn)生β-酪啡肽-7（BCM-7），而BCM-7可能與過敏、消化吸收障礙有關(guān)。A1和A2β-酪蛋白區(qū)別在于第67位氨基酸的不同，這種分子結(jié)構(gòu)細(xì)微的差別，為后期分離和純化帶來了挑戰(zhàn)，也是市面上還無商業(yè)化的A1和A2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可供使用的重要原因。來自乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在實(shí)驗(yàn)研究中，借助大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)，通過構(gòu)建特定β-酪蛋白變異體表達(dá)系統(tǒng)，探索了A1和A2β-酪蛋白生物合成的可能性。這也將幫助科研人員為后續(xù)乳蛋白定向合成以及相關(guān)乳制品的A1和A2蛋白定量檢測(cè)提供基礎(chǔ)。

通過在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中查找β-酪蛋白有224氨基酸序列（P02666），其中在N端包含15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。根據(jù)A1和A2蛋白在氨基酸組成上的差異分別得到對(duì)應(yīng)的氨基酸序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的堿基序列。根據(jù)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的堿基序列和相應(yīng)的帶Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行目的片段的克隆。

通過Prot Param軟件對(duì)A1和A2蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析得到對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，A1和A2蛋白分子量在25 kDa左右，親疏水性基本相同。

分別構(gòu)建含有CSN2-A1和CSN2-A2目的基因的重組質(zhì)粒載體pET28a（+）-CSN2-A1和pET28a（+）-CSN2-A2。將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化。結(jié)果表明，在0.2 mmol/L IPTG，37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)4 h可獲得大量蛋白，但通過SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，存在于細(xì)胞破碎后的沉淀中。通過洗滌、溶解、鎳柱親和色譜純化、復(fù)性以及鑒定等步驟最終可獲得純度大于90%（PAGE）的A1和A2重組蛋白。

不同A1/A2重組菌體誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

注：M：Marker；1：未誘導(dǎo)；2~6：誘導(dǎo)后不同單克隆菌株

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A1和A2包涵體蛋白經(jīng)過清洗、復(fù)溶和純化后在25 kDa附近出現(xiàn)目的蛋白條帶以外基本無其他雜蛋白，因此達(dá)到了預(yù)期純化目標(biāo)。

A1和A2重組表達(dá)菌株誘導(dǎo)后得到的沉淀樣、復(fù)溶以及純化后樣品SDS-PAGE電泳圖

注：M：Marker；1：破碎后沉淀；2：破碎溶解后上清；3：過柱流出液；4：清洗樣；5：洗脫樣

包涵體通過純化后利用透析袋進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的重組的A1和A2蛋白樣品。SDS-PAGE檢測(cè)后呈單一條帶，且純度超過90%。

A1和A2蛋白作為β-酪蛋白兩種常見的變異體類型，由于兩者在分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異使其在用常規(guī)方法制備和純化上存在困難。這項(xiàng)研究最終獲得的A1和A2重組蛋白含量分別為1.5和2.0 mg/mL，這也為人工合成特定變異體的β-酪蛋白提供了新的借鑒。

普健生物作為一站式蛋白抗體開發(fā)專家，在蛋白表達(dá)領(lǐng)域深耕15余年，擁有20000+重組蛋白表達(dá)與純化經(jīng)驗(yàn)。通過對(duì)E.coli表達(dá)系統(tǒng)的豐富經(jīng)驗(yàn)以及熟練掌握，在E.coli系統(tǒng)上的蛋白可溶性表達(dá)成功率達(dá)到90%以上。如果您在實(shí)驗(yàn)中存在目標(biāo)蛋白不穩(wěn)定，或正在考慮重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、生產(chǎn)和純化，歡迎您實(shí)時(shí)與我們項(xiàng)目專員溝通！服務(wù)咨詢電話：027-87001869

普健生物（AtaGenix）于2011年在武漢成立，作為武漢國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務(wù)平臺(tái)—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務(wù)平臺(tái)。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現(xiàn)等自主技術(shù)平臺(tái)的建設(shè)和下游生物醫(yī)藥產(chǎn)品的戰(zhàn)略合作。經(jīng)過10余年的發(fā)展，普健生物已成為一家立足武漢，業(yè)務(wù)覆蓋全國(guó)、輻射全球的高新技術(shù)服務(wù)企業(yè)。目前公司擁有4700平米自建實(shí)驗(yàn)室（包含800平高標(biāo)準(zhǔn)BSL-2級(jí)細(xì)胞房），擁有齊全蛋白抗體開發(fā)設(shè)備500余套，包括高通量蛋白純化儀、Agilent流式細(xì)胞分析儀，全自動(dòng)HPLC分析儀，openSPR蛋白、抗體親和力測(cè)定儀，Olympus熒光顯微鏡，BTX電融合儀，2*7L微生物發(fā)酵罐，中試型高壓均質(zhì)機(jī)，全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光儀，以及配套的高速離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及大容量細(xì)胞培養(yǎng)搖床。公司先后獲得榮譽(yù)：3551人才計(jì)劃、高新技術(shù)企業(yè)、技術(shù)先進(jìn)型服務(wù)企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] CAROLI A M, SAVINO S, BULGARI O, et al. Detecting β-casein variation in bovine milk[J]. Molecules,2016,21(2):141−147.

[2] LUO Benben, JIN Suyu, HUANG Lin, et al. Analysis of yak β-casein A1 and A2 genetic variants on the level of gene and protein[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2020,（06）: 133-135, 140, 158.

[3] CHEN Long, FU Wangyan, FANG Qiongyan, et al. Recent advances of β-casein genotyping in bovine milk and potential impact of β-casomorphin-7 on human health[J]. China Dairy Industry, 2019, 47(08): 29-34.

[4] CHEN Ailiang. Casein polypeptide, polypeptide antigen, antibody, test strip and its application. CN114716531A[P]. 2022-07-08.

[5] AI Zhengwen. Preparation of β-Casein Based on Escherichia coli Expression System[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(16): 131−138.