上期推文《終于有人把主流的單抗開發(fā)平臺總結清楚了?》中，小編和大家介紹了各種高效且目前主流的單抗開發(fā)平臺，從本篇開始，讓我們一起關注這些更具獨特性的抗體制備方法和抗體應用方向。

泛素和泛素化

　　泛素(ubiquitin，Ub)是一種小分子多肽，由76個氨基酸組成并廣泛分布于真核細胞中。其主要功能是非底物特異性的標記需要降解的蛋白質，主要存在形式包括：游離的泛素、多泛素鏈、泛素化蛋白;不同形式存在的泛素含量反映了細胞的不同生理狀態(tài)。

不同類型的泛素化

　　泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶(如泛素激活酶、結合酶、連結酶、降解酶等)的作用下，將細胞內(nèi)的蛋白質進行分類，篩選出靶蛋白分子并對其進行特異性修飾的過程。由于泛素化的多樣性與多價性，泛素化廣泛參與包括細胞增殖、分化、凋亡、自噬、DNA損傷修復、免疫應答等各種生理過程，是近年來生物化學研究的一個重大成果，已成為新藥開發(fā)的主要方向之一。

泛素化的具體過程

　　泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應：

　　在ATP供能的情況下E1粘附在泛素分子尾部活化泛素分子生成Ub-E1復合體，E1將激活的泛素分子轉移到E2酶上形成Ub-E2復合體。隨后，E2酶和一些種類不同的E3酶共同識別靶蛋白，對其進行泛素化修飾。根據(jù)E3與靶蛋白的相對比例可以將靶蛋白單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。

泛素化過程(Stone, Sophia L., 2019)

E1：泛素激活酶E1;E2：泛素偶聯(lián)酶E2;E3：泛素連接酶E3;

Target：靶蛋白;Ubiquitin：泛素;DUBs：去泛素化酶。

　　P.S.單個泛素分子以其C-末端賴氨酸與靶蛋白的一個Lys側鏈相連叫做單泛素化，與多個賴氨酸殘基相連叫做多泛素化。如果靶蛋白的單個Lys殘基被多個泛素分子標記則稱為多聚泛素化。

　　簡而言之，也就是在E1、E2、E3三類酶的順序催化下，泛素被以特異性的方式連接到靶標蛋白質或靶標蛋白質上已連接的泛素鏈上，其中E3泛素化連接酶決定靶蛋白的特異性識別。蛋白質泛素化的結果是使得被標記的蛋白質被蛋白酶分解為較小的多肽、氨基酸以及可以重復使用的泛素。

泛素化抗體的應用

　　自泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在20世紀80年代初被發(fā)現(xiàn)以來，與其相關的研究成果層出不窮。泛素對細胞的生命活動不可或缺，但由于泛素化的復雜性，人們目前的認知也只是冰山一角，很多問題仍有待研究。泛素化抗體適用于檢測不同形式的泛素，以幫助科研人員了解細胞在生命活動中差異顯著的蛋白質的性質，研究這些變化的規(guī)律，可幫助科研人員準確定位泛素化靶點和靶向相關疾病的治療。例如，診斷阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)原纖維纏結和成對螺旋絲，帕金森病中的路易小體，以及尼曼-匹克病中的匹克小體都是高度泛素化的，可以很容易地用泛素抗體檢測到。

如何檢測蛋白是否泛素化

　　1、免疫沉淀反應

　　通過免疫共沉淀方法分離特定蛋白質及其結合蛋白(包括被泛素化修飾的蛋白)。分離出的蛋白經(jīng)SDS電泳后用泛素抗體進行western blot分析，可以鑒定具體哪個蛋白發(fā)生了泛素化修飾以初步判斷某蛋白具有泛素化功能。

　　2、體外泛素標記突變位點

　　將研究蛋白(被泛素化的蛋白)通過蛋白提取試劑盒提取內(nèi)源性蛋白或通過基因工程技術重組表達后提純。用k63或k48連接的泛素鏈肽段系列酶E1、E2、E3在適當條件下體外孵育，然后用泛素抗體進行western blot分析。該方法可以明確所研究蛋白的哪個賴氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。

　　3、體外泛素化實驗

　　將待研究蛋白A(被泛素化的蛋白)與UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及待研究的蛋白B(具有泛素連接酶E3活性)在體外反應緩沖液中共同進行孵育。將孵育后的產(chǎn)物進行IP和WB分析。該方法可以明確B蛋白具有E3連接酶活性且是引起A蛋白發(fā)生泛素化修飾的關鍵因素。

　　普健生物除可進行常規(guī)的單抗、多抗制備外，還可定制如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修飾性抗體，抗體制備經(jīng)驗豐富，抗體發(fā)現(xiàn)平臺完善。