內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖，主要由類脂A、0-特異性多糖側(cè)鏈和核心寡聚糖三部分組成。

內(nèi)毒素的生物學(xué)功能：

1、致熱性

2、對(duì)細(xì)菌細(xì)胞外膜有保護(hù)作用

3、誘導(dǎo)白細(xì)胞粘連分子粘連到內(nèi)皮細(xì)胞上

4、刺激中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)其形態(tài)發(fā)生改變

5、促發(fā)凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血

6、導(dǎo)致器官損傷，中毒性休克

7、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

8、具有免疫佐劑活性

9、激活補(bǔ)體，發(fā)揮天然的免疫應(yīng)答效應(yīng)

 

內(nèi)毒素的檢測(cè)方法

 

鱟試劑法 

具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)內(nèi)毒素的金標(biāo)準(zhǔn)。但這種方法有兩大缺陷，檢測(cè)結(jié)果易受樣品本身的顏色及濁度影響，必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理；需要捕殺大量保護(hù)動(dòng)物鱟。因此，鱟試劑法的替代方法備受關(guān)注，如：羅氏蛋白染色法、焚光偏振法、同位素標(biāo)記法、ELISA等，其中ELISA應(yīng)用較為廣泛。

 

ELISA 

具有特異性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以直接檢測(cè)含高濃度內(nèi)毒素（如發(fā)熱病人血清）的樣本，但其檢測(cè)靈敏度較當(dāng)試劑法有較大差距，對(duì)于環(huán)境中的低濃度內(nèi)毒素，往往需要進(jìn)行樣品預(yù)處理后才能檢測(cè)。此外，使用的內(nèi)毒素抗體產(chǎn)品劑量少、成本高，對(duì)溫度、有機(jī)溶劑耐受性差，極大的限制了ELISA在環(huán)境樣品內(nèi)毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。

 

利用分子印跡技術(shù)所制備的人工抗體（MIP），可特異性識(shí)別和結(jié)合IE分子，并具有穩(wěn)定性好、能耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿等特點(diǎn)，已廣泛用于固相萃取、親和層析等樣品預(yù)處理和分析技術(shù)中。將MIP與ELISA技術(shù)相結(jié)合，可以充分發(fā)揮MIP的特異性吸附作用，高效分離和富集樣品中殘留的內(nèi)毒素，同時(shí)在ELISA中引入發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以提高內(nèi)毒素檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

 

內(nèi)毒素的去除

 

內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均一，導(dǎo)致內(nèi)毒素可以多種方式與溶液中的蛋白質(zhì)相互作用，形成復(fù)合物，大大增加了去除的難度。

 

內(nèi)毒素的去除可采用親合層析法、離子交換層析法、疏水層析法、凝膠過濾層析法、超濾法、吸附法等。

 

去除方法

 

親合層析法

 

原理：利用被分離的生命大分子物質(zhì)和特異性配體之間能可逆結(jié)合與解離；從內(nèi)毒素的空間排布及立體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，篩選能與其互補(bǔ)親和的配基

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，分離效率高，保留活性，作用力強(qiáng)，選擇性高

不足：必須找到與分離物質(zhì)合適的配體，成本高，范圍受限

離子交換層析法

原理：內(nèi)毒素在pH>2時(shí)帶負(fù)電荷，與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE基團(tuán)有較強(qiáng)結(jié)合，可用高鹽緩沖液或NaOH去除

優(yōu)點(diǎn)：適于從堿性蛋白質(zhì)中去除，成本低，吸附容量大

不足：不適合于溶液中存在其他帶負(fù)電荷物質(zhì)的情況

疏水層析法

原理：內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性，在高鹽下會(huì)凝集，無法掛上疏水層析柱

優(yōu)點(diǎn)：可選擇能結(jié)合目標(biāo)蛋白的疏水介質(zhì)而去除內(nèi)毒素

不足：適用對(duì)象受限

凝膠過濾層析法

原理：內(nèi)毒素多為多聚體，根據(jù)分子大小可以有效分離

簡(jiǎn)單有效

不足：處理量小，耗時(shí)長(zhǎng)

超濾法

原理：原液及保護(hù)劑的分子量與內(nèi)毒素分子量差別較大，選擇合適的超濾膜

優(yōu)點(diǎn)：適用于目標(biāo)產(chǎn)物分子量小的溶液

不足：活性損失大

吸附法

原理：熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去

優(yōu)點(diǎn)：?適合于組分較為簡(jiǎn)單的小分子的溶液中去除

不足：易吸附有效成分，殘余活性炭不易去除