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殘余牛血清白蛋白（BSA）含量檢測是生物制品質量控制的一項重要指標，直接關系到生物制品的使用安全。世界衛(wèi)生組織及世界各國藥典對殘余BSA含量均有嚴格限定。《中國藥典》（三部）2020版規(guī)定，成品中牛血清白蛋白殘留量不得>50ng/劑。因此，需要利用特異性好，靈敏度高的抗體建立一種簡便、高效的牛血清白蛋白殘留量檢測方法。
牛血清廣泛使用于生物制品研究、制備過程中，雖然在生產過程中經(jīng)純化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制劑成品中。在人體中，超過一定濃度的BSA易引起人的免疫病理反應，引起嚴重的副作用，影響生物制品的安全性。普健生物基于客戶需求，對BSA有更為嚴苛的控制標準，此前我們基于鼠抗開發(fā)平臺開發(fā)出靈敏度為0.51ng/ml，可檢測1.56-100ng/mL的BSA檢測試劑盒。能滿足現(xiàn)行藥典規(guī)范BSA殘留檢測要求，并有了穩(wěn)定的客戶群體。但在后續(xù)的產品回訪中，我們的項目經(jīng)理進一步了解了客戶的項目對BSA殘留其實有更為嚴苛的控制標準，只是苦于市售產品檢測限以及靈敏度未能完全滿足。普健生物技術團隊深挖客戶需求，結合普健生物最新推出的XtenTMMab兔單克隆抗體開發(fā)技術，為客戶提供了一種全新、高效、高靈敏度的BSA檢測解決方案。
本公司利用兔單B細胞抗體開發(fā)技術，從BSA免疫的兔外周血中，分離BSA特異性的單B細胞，通過PCR 擴增及測序分析， 獲得多個特異性識別BSA蛋白的抗體。
本方案篩選的兔單抗較傳統(tǒng)方法雜交瘤技術篩選的抗體及兔多抗的親和力和特異性更高，具有靈敏度高、穩(wěn)定性強的特點，檢測范圍為0.78-50ng/mL，為開發(fā)高靈敏度的BSA殘留檢測試劑盒奠定了堅實的基礎。
圖1 普健生物XtenTMMab兔單克隆抗體開發(fā)流程
利用普健生物開發(fā)的快速免疫方法免疫新西蘭大白兔，三免（Day21）血清效價大于128K，可以進行后續(xù)單B細胞流式分選。然后將從PBMC中分離篩選到的B細胞進行抗原特異性檢測，陽性率大于60%。
|
抗原 |
BSA |
|
包被 |
1ug/ml*100ul |
|
2k |
4k |
8k |
16k |
32k |
64k |
128k |
PBS |
效價 |
|
|
三免血清效價 |
4.32 |
3.32 |
3.26 |
2.98 |
2.53 |
1.85 |
1.16 |
0.03 |
>128K |
圖2 BSA兔血清三免（Day21）效價檢測結果
圖3 單B細胞ELISA檢測部分結果展示
根據(jù)單B細胞ELISA檢測結果，挑選12個克隆進行抗體基因測序及分析，12個克隆測序全部成功。
圖4 抗體可變區(qū)基因分析結果
將測序得到的12個抗體挑選10個，利用普健生物自主開發(fā)的XtenCHO系統(tǒng)進行重組表達，純化后得到純度高，親和力好的重組兔單抗。10株重組兔單抗ELISA效價均大于1:1000000。
圖5 重組兔抗SDS-PAGE檢測結果
圖6 純化后重組兔抗ELISA檢測結果
將10株重組兔單抗進行方陣實驗配對，得到多對靈敏度高的抗體對，優(yōu)選其中一對, 標曲線性范圍0.78-50ng/mL, R2=0.9992。
圖7 BSA抗體對標準曲線
為了了解不同方法制備抗體親和力的差異，我們將BSA的兔單抗與之前自產的用傳統(tǒng)雜交瘤制備的BSA鼠單抗進行了親和力的測試。在此，我們利用OPENSPR將鼠單抗、兔單抗和BSA進行了親和力檢測，發(fā)現(xiàn)兔單抗的親和力比鼠單抗高1-2個數(shù)量級。
| ka(1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) | |
| BSA&兔抗3D5 |
2.21E+05 |
1.90E-05 |
8.61E-11 |
| BSA&兔抗6B7 | 1.39E+05 | 7.49E-06 | 5.38E-11 |
| BSA&鼠抗1 | 2.81E+04 | 1.39E-04 | 4.95E-09 |
| BSA&鼠抗2 | 1.48E+05 | 2.02E-05 | 1.36E-10 |
剩余未分選的B細胞以及篩選陽性的其他單B細胞可以凍存，以便用于后續(xù)篩選其他應用需求的抗體。
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普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達系統(tǒng)，Single B細胞抗體發(fā)現(xiàn)技術平臺，噬菌體展示抗體庫技術和雜交瘤抗體開發(fā)平臺，抗體表達、抗體人源化和穩(wěn)定細胞株構建平臺，與各研究機構展開技術服務項目合作，助力IVD檢測、疫苗生產、重組抗體開發(fā)。
普健生物一站式抗體發(fā)現(xiàn)平臺，專注于活性蛋白，功能性抗體開發(fā)。
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