Selli等人發(fā)現(xiàn)，雖然攜帶CD28的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞通過腫瘤或慢性感染刺激下發(fā)生的經(jīng)典事件，從而發(fā)生功能障礙和耗竭，但攜帶4-1BB的CAR-T細(xì)胞則以由轉(zhuǎn)錄因子FOXO3驅(qū)動的不同方式發(fā)生功能障礙。

十多年前，CAR-T細(xì)胞被證明對B細(xì)胞惡性腫瘤具有顯著的療效。它們均靶向B細(xì)胞分子CD19，并帶有CD28或4-1BB中1個共刺激分子的胞內(nèi)信號域。研究者假設(shè)將共刺激結(jié)構(gòu)域并入CAR可改善持久性和功能，從而改善抗腫瘤作用。由于這些初始產(chǎn)品取得顯著的初步成功，美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的所有6種構(gòu)建物，包括針對骨髓瘤漿細(xì)胞表達(dá)的b細(xì)胞成熟抗原的構(gòu)建物，以及臨床開發(fā)中的大多數(shù)其他CAR，包括各種適應(yīng)癥，都包含這兩個信號域中的一個。

由于CAR以高親和力識別抗原，并且由組成型啟動子表達(dá)，因此研究者早期注意到，抗原的持續(xù)刺激（有時甚至是CAR的高水平表達(dá)）可導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙。這些功能失調(diào)的T細(xì)胞在抗原刺激后的細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖能力降低；這可以通過中斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的休息來克服。在患者中，高腫瘤負(fù)荷與應(yīng)答降低和T細(xì)胞功能障礙增加相關(guān)。到目前為止，這種功能障礙被認(rèn)為在本質(zhì)上與T細(xì)胞“耗竭”是相同的現(xiàn)象，而T細(xì)胞“耗竭”已經(jīng)在接受檢查點(diǎn)阻斷治療的慢性病毒感染和癌癥中得到了廣泛描述。

Selli等通過重復(fù)體外刺激攜帶CD28或4-1BB胞內(nèi)信號域的CD19導(dǎo)向的CAR T細(xì)胞來模擬慢性激活，從而產(chǎn)生功能障礙，然后對轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和表型程序進(jìn)行了全面分析。每48小時用低效靶比的新腫瘤細(xì)胞刺激CAR T細(xì)胞。2周后，CAR T細(xì)胞失去了殺傷抗原陽性靶點(diǎn)的能力，不能再產(chǎn)生細(xì)胞因子，也不能再增殖。接下來，他們利用飛行時間的多參數(shù)細(xì)胞測定法從表型上研究了這些功能失調(diào)的CAR T細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，含有CD28的CAR - T細(xì)胞具有典型T細(xì)胞耗竭的特征，包括PD-1、TIGIT、LAG3、TIM3和CTLA4的重新表達(dá)（見圖）。相比之下，攜帶4-1BB CARs的功能失調(diào)T細(xì)胞占據(jù)不同的T分布隨機(jī)鄰居嵌入空間，其表面表達(dá)更高的CD62L和CD25。使用RNA測序檢查這些功能失調(diào)的CAR T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序顯示，基于CD28的CAR T細(xì)胞高度富集與耗竭相關(guān)的基因，而基于4- 1BB的功能失調(diào)的CAR T細(xì)胞沒有典型的耗竭標(biāo)簽。
最近關(guān)于T細(xì)胞衰竭的研究強(qiáng)調(diào)，這種狀態(tài)是由特定的表觀遺傳改變決定的。研究人員還使用染色質(zhì)開放性測序技術(shù)（ATAC-seq）證實(shí)了這些差異，特別是PD1編碼基因（PDCD1）的染色質(zhì)可及性測定法，在基于CD28的CAR T細(xì)胞中，這看起來像是典型的耗竭，但在基于4- 1BB的CAR T細(xì)胞中并非如此。研究人員隨后使用縱向單細(xì)胞RNA測序，確定大多數(shù)功能失調(diào)的4-1BB CAR T細(xì)胞是由一組涉及細(xì)胞毒性（GNLY、CCL5、PRF1、GZMA、GZMK、CTSW）、自然殺傷細(xì)胞特性（KLRK1、KLRC2）和T細(xì)胞分化（ID2）的獨(dú)特基因定義，他們將這些基因稱為TBBD標(biāo)簽。有趣的是，他們的TBBD標(biāo)簽在接受抗CD19 /4- 1BB CAR構(gòu)建物Tisagenlecleucel治療的1例患者中得到了證實(shí)，該患者雖然血液中有CAR T細(xì)胞，但淋巴瘤仍發(fā)生進(jìn)展。



攜帶不同共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞在慢性刺激后功能失調(diào)時表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和表型特征。攜帶4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞重新激活FOXO3，其驅(qū)動一種不同于經(jīng)典T細(xì)胞衰竭的新功能障礙程序。

為了了解這種功能障礙的新型分子程序的起源，研究團(tuán)隊(duì)研究了隨著時間的推移轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的可及性。正如預(yù)期的那樣，CD28-CAR功能障礙增加了Jun:Fos（AP1）結(jié)合的可及性，但相反，4-1BB-CAR功能障礙打開了同源盒（HOX）和叉頭框（FOX）位點(diǎn)，并且小的條理性RNA測序數(shù)據(jù)顯示FOXO3活性高。此外，在機(jī)制研究中，通過CRISPR/Cas干擾FOXO3可使患者對重復(fù)抗原刺激后的功能障礙產(chǎn)生抵抗，相反，FOXO3過表達(dá)顯著減少了4-1BB（而非CD28） CAR T細(xì)胞在重復(fù)抗原刺激下的擴(kuò)增。在小鼠異種移植應(yīng)激模型中，注射極少量的CAR T細(xì)胞治療較高的腫瘤負(fù)荷，攜帶4-1BB胞內(nèi)信號域的FOXO3敲除CAR T細(xì)胞改善了生存。

值得注意的是，研究人員通過深度技術(shù)探究（從高維細(xì)胞測定到縱向單細(xì)胞RNA測序）發(fā)現(xiàn)了一種新的分子機(jī)制，同時仍然使用相對簡單的體外模型（重復(fù)抗原刺激）。分子程序本身和FOXO3的重新激活是有趣的，可能在自然界中并不常見。在自然生物學(xué)中，4-1BB刺激與T細(xì)胞受體（TCR）刺激在時間上分離，而TCR表達(dá)本身隨著抗原暴露而循環(huán)，因此減少了緊張信號傳導(dǎo)的可能性。未來的研究可能包括在更多接受Tisagenlecleucel治療但無應(yīng)答的患者中進(jìn)一步驗(yàn)證TBBD轉(zhuǎn)錄特征和FOXO3活性。同樣，無論疾病狀態(tài)如何，我們都應(yīng)基于對新生CD19+ B細(xì)胞的長期暴露，進(jìn)一步了解Tisagenlecleucel在患者中是否會耗竭。有趣的是，在接受治療的前2例患者（這2例患者均有長期緩解）中，長期暴露于新生B細(xì)胞被認(rèn)為在Tisagenlecleucel持續(xù)10年的過程中發(fā)揮了作用。此外，當(dāng)BCMA陽性骨髓瘤患者在使用BCMA導(dǎo)向的CAR T細(xì)胞持續(xù)存在的情況下復(fù)發(fā)時，對于對其他抗原具有特異性的、攜帶4- 1BB的CAR T細(xì)胞（例如已批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的兩種靶向B細(xì)胞成熟抗原[BCMA]的CAR T細(xì)胞）是否也表現(xiàn)出TBBD標(biāo)簽和FOXO3再激活，這將是該領(lǐng)域的興趣。最后，在機(jī)制水平，研究FOXO3敲除或C-Jun過表達(dá)在減少CAR-T細(xì)胞耗竭方面是否更有效將是有趣的。

參考文獻(xiàn)
1.Selli ME, Landmann JH, Terekhova M, et al. Costimulatory domains direct distinct fates of CAR-driven T-cell dysfunction. Blood. 2023;141（26）:3153-3165.
2.Kochenderfer JN, Dudley ME, Feldman SA, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 2012;119（12）:2709-2720.
3.Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 2011;365（8）:725-733.
4.Brentjens RJ, Davila ML, Riviere I, et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med. 2013;5（177）:177ra38.
5.Weber EW, Parker KR, Sotillo E, et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 2021;372（6537）:eaba1786.
6.Locke FL, Rossi JM, Neelapu SS, et al. Tumor burden, inflammation, and product attributes determine outcomes of axicabtagene ciloleucel in large B-cell lymphoma. Blood Adv. 2020;4（19）:4898-4911.
7.Blank CU, Haining WN, Held W, et al. Defining 'T cell exhaustion'. Nat Rev Immunol. 2019;19（11）:665-674.
8.Sen DR, Kaminski J, Barnitz RA, et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science. 2016;354（6316）:1165-1169.
9.Melenhorst JJ, Chen GM, Wang M, et al. Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4（+） CAR T cells. Nature. 2022;612（7941）:E22.
10.Lynn RC, Weber EW, Sotillo E, et al. c-Jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature. 2019;576（7786）:293-300.