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自1975年第一支單克隆抗體誕生以來，越來越多的抗體（如嵌合抗體，人源化抗體，以及全人源抗體）被應用于各種包括癌癥、自身免疫、代謝和傳染病的診斷和治療，顯示出不斷擴大的應用前景。然而，在大多數(shù)情況下，較小尺寸的抗體不穩(wěn)定，導致多聚體（特別是單鏈可變片段，scFv）較低的親和力結合，以及大規(guī)模生產(chǎn)的挑戰(zhàn)。
The various antibody formats: (A) mAb (monoclonal antibody); (B) Fab (fragment antigen binding); (C) HcAb (camel heavy-chain antibody); (D) VHH or Nb (nanobody). Adapted from Yang X, Xie S, Yang X, et al. Opportunities and Challenges for Antibodies against Intracellular Antigens. Theranostics.
駱駝和鯊魚體內(nèi)天然存在一種缺乏輕鏈的獨特抗體，稱為可變重鏈域，又稱納米抗體（nanobody，VHH）。該抗體僅包含一個可變區(qū)，體積?。s15kDa）、親和力高、特異性強、穩(wěn)定性高、組織穿透性強、高效表達、低毒性和低免疫原性等特點，在生化機制、結構生物學、腫瘤等疾病的診斷和治療等方面有著廣泛的應用。
Comparison between traditional IgG antibody and camelid heavy-chain antibody. (A) Traditional IgG antibody has two identical heavy chains, consisting of VH, CH1, CH2, and CH3 domains, and two identical light chains, consisting of VL and CL domains. (B) Camelid heavy-chain antibody contains one VHH and two constant domains (CH2 and CH3). A Nb is the VHH domain of heavy-chain antibody obtained by recombinant gene technology. (C) The difference in amino acid sequence of VH and VHH. The average length of the CDR1 and CDR3 is better in the VHH domain than in the VH domain. The dotted line indicates the additional disulfide bond between CDR1 and CDR3 of the VHH domain. The Numbering of the international ImMunoGeneTics-IMGT information system is pointed out.
納米抗體和傳統(tǒng)抗體的優(yōu)劣對比
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性能 |
傳統(tǒng)抗體 |
納米抗體 |
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抗體表達 |
在哺乳表達系統(tǒng)中表達，周期長、成本高 |
既可在哺乳系統(tǒng)中表達，又可在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達，表達的抗體具有高水溶性、易復性 |
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抗體穩(wěn)定性 |
易失活，高溫或極度PH下失效或分解 |
高穩(wěn)定性，高耐性，90℃處理后依然保持較高的活性 |
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免疫原性 |
較高 |
較低 |
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組織穿透力 |
較低 |
較高，可穿透血腦屏障 |
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半衰期 |
較長 |
較短，血清清除速度快 |
納米抗體的制備
基于完備的抗體開發(fā)技術平臺以及高效的重組蛋白表達系統(tǒng)，普健生物提供一站式納米抗體（VHH）制備服務。納米抗體的獲得主要通過免疫羊駝，由羊駝體內(nèi)自身抗體成熟階段來得到抗體基因，然后通過噬菌體展示篩選技術來從羊駝抗體庫中篩選得到最適合的抗體序列。納米抗體制備的整個流程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構建、抗體篩選、抗體表達及功能驗證四個階段。
羊駝免疫
?每只羊駝可以同時免疫1-5個抗原，每次免疫總的抗原量保持在1-2mg之間，體積在2mL以下，將抗原和佐劑1：1乳化使其形成均勻混合物，4°保存，共進行四輪免疫。
噬菌體文庫構建
?抽提羊駝淋巴細胞中RNA并反轉成cDNA文庫，利用特殊設計的引物在cDNA文庫中再次進行PCR擴增，得到特異的基因片段。隨后將特異的基因片段拼接重組在噬菌體載體上，并轉染大腸桿菌，最終完成納米抗體基因文庫的構建。
抗體篩選
?將靶點抗原或者帶有抗原的物質(zhì)直接/間接的固定在固體載體上，隨后加入噬菌體文庫和抗原相互作用。作用一段時間后陽性噬菌體會和抗原結合，用洗滌液洗滌固體載體表面，可以將未結合或非特異結合的噬菌體洗去。隨后用強酸或者強堿破壞固體載體上抗原和陽性噬菌體的結合，從而得到陽性噬菌體溶液。一般重復進行2-3輪的篩選即可獲得符合開發(fā)要求的納米抗體克隆。
抗體表達及功能驗證
通過噬菌體文庫淘選出的納米抗體克隆菌株進行納米抗體片段DNA測序后即可進行表達純化及驗證。納米抗體可在大腸桿菌，酵母或哺乳動物細胞系里進行表達，因其僅含100多個氨基酸殘基，為驗證其是否與抗原結合，可構建質(zhì)粒在大腸桿菌中或酵母菌株中進行快速表達及純化。
普健生物擁有包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、哺乳動物表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)在內(nèi)的五種表達系統(tǒng)，相比傳統(tǒng)納米抗體大多采用原核表達系統(tǒng)，普健生物提供源自法國先進的XtenCHO™高密度瞬轉表達系統(tǒng)，能更好的保證抗體正確修飾與活性。如果您近期有納米抗體定制需求，歡迎點擊文字鏈接或閱讀原文了解更多服務內(nèi)容，或實時與我們項目專員溝通！服務咨詢電話：027-87001869
我們的優(yōu)勢
自建養(yǎng)殖基地：每年近百頭成年羊駝用于免疫，穩(wěn)定提供大量的免疫抗原
庫容大：近千億級別天然庫
淘選周期短：最快在2周內(nèi)可完成針對各類靶點的特異性納米抗體快速篩選
親和力高：抗體親和力可達10-9M 級別
樣本來源豐富：免疫庫源自百余只不同種類的駝類樣本-羊駝（Alpaca ）、駱駝（Camel）、美洲駝（Llama），提供更高抗體多樣性
超高品質(zhì)：插入正確率100%，序列正確率97%，隨機選取200個克隆測序，均無重復序列
可構建免疫庫，獲得更高親和力VHH序列
案例展示
第一輪單克隆ELISA驗證
第二輪單克隆ELISA驗證
ELISA驗證重組納米抗體與抗原結果
重組納米抗體與抗原親和力測定結果
本章小結
今天我們對納米抗體的介紹先告一段落啦
本期我們介紹了納米抗體的結構、納米抗體的特點、
納米抗體的制備流程、普健生物納米抗體服務及實例展示
下期我們將繼續(xù)為您介紹納米抗體在臨床的應用
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下期不見不散！
未完待續(xù)……
